En este estudio se analiza la incidencia de multinucleación y la tasa de implantación de embriones con blastómeras multinucleadas frente a la tasa de implantación de embriones con blastómeras mononucleadas con el objetivo de determinar una tasa de implantación para los embriones multinucleados y ver cómo puede influir la multinucleación en el éxito de la selección embrionaria.

Se analizan retrospectivamente 245 embriones transferidos en ciclos de FIV-ICSI en el día 2 de desarrollo; de éstos, encontramos: 92 embriones mononucleados y 74 embriones que presentaban al menos una célula binucleada.

En el grupo de embriones multinucleados, 3 de 57 embriones dieron lugar a la formación de un saco gestacional (tasa de implantación = 5,3%). En el grupo de embriones mononucleados, 26 de 85 embriones dieron lugar a la formación de un saco gestacional (tasa de implantación = 30,6%). La diferencia entre grupos es estadísticamente significativa (p<0,001).

Los embriones que presentan multinucleación tienen una tasa de implantación menor que los embriones cuyas células poseen un núcleo único. Estos datos evidencian que la presencia de multinucleación tiene una incidencia significativa en el potencial implantatorio de los embriones, y que visualizar los núcleos supone una mejor determinación de la calidad embrionaria y por lo tanto una mejor selección de los embriones que van a ser transferidos. Debido a esto, la visualización de los núcleos en la práctica diaria en los laboratorios de reproducción asistida es un procedimiento que debe seguir siendo considerado de gran importancia en la valoración morfológica de los embriones.

INTRODUCCIÓN

Las técnicas de reproducción asistida (TRAs) han experimentado un gran avance en los últimos 30 años, desde que naciera la primera niña por medio de una fecundación in vitro (FIV) en 1978. Dado el éxito de estas técnicas, actualmente los avances se enfocan en la mejora de los tratamientos, tanto a nivel de procedimientos como del impacto que éstos puedan tener sobre los pacientes. A nivel de laboratorio, uno de los objetivos principales es la mejora en la selección de los embriones que van a ser transferidos finalmente.

La tendencia está en que, alcanzado un determinado nivel de calidad en el tratamiento y en los procedimientos de laboratorio, se consiguiera llegar a la transferencia electiva de un único embrión (eSET, elective single embryo transfer) y así reducir los riesgos que supone para una mujer un embarazo múltiple, sin reducir las probabilidades de lograr un embarazo a término. Además, la

transferencia de un único embrión nos proporciona datos fiables acerca de la correlación entre la selección morfológica y el éxito del tratamiento (De Neubourg et al., 2004).

Actualmente y según la ley de reproducción asistida (LEY 14/2006, de 26 de mayo, sobre técnicas de reproducción humana asistida) en España sólo se permite la transferencia de máximo 3 embriones. En la práctica habitual esto sólo se produce cuando los tres embriones son de baja calidad y por tanto la media de embriones transferidos en las clínicas españolas es de 2,0 con oocitos propios (Registro SEF, 2009).

Las transferencias de embriones se pueden realizar en distintos momentos del desarrollo: en el segundo día posfecundación (D+2), que en una situación ideal corresponde con un embrión de cuatro células; en el tercer día posfecundación (D+3) que correspondería con un embrión de 8 células y en el quinto o sexto día posfecundación, ya en estadio de blastocisto.

VALORACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS EMBRIONES

El éxito de la selección embrionaria es el principal objetivo en un laboratorio de reproducción asistida. Para esta selección en la actualidad se utilizan principalmente parámetros morfológico.

La valoración morfológica de los embriones se compone de distintas variables entre las que destacan, el número de células, el grado de fragmentación y la correcta división de las células durante los primeros días de desarrollo. Además de éstas, el número de núcleos y en particular, la multinucleación, resultan características de alto valor predictivo de la viabilidad de un embrión, como así se demuestra en numerosos estudios.

La multinucleación se define como la presencia de más de un núcleo en una de las blastómeras de un embrión y es visible durante la interfase en los distintos estadios del desarrollo embrionario

Los criterios de selección embrionaria se basan en características morfológicas de los embriones, visualizados desde el momento de la fecundación hasta el día 6 de desarrollo. En este campo, España ha sido uno de los países pioneros en la búsqueda de un consenso para la unificación de estos criterios que facilite: la comparación de los datos entre diferentes laboratorios, la realización de estudios multicéntricos y la comunicación de los resultados en las revistas científicas. Las recomendaciones para la categorización de los embriones según estas características morfológicas fueron publicadas por la Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR). Estos criterios morfológicos siguen una jerarquía dependiendo del día de observación y de cuál de ellos resulta más predictivo de la viabilidad del embrión, en esta publicación, la visualización de multinucleación en una sola de las blastómeras supone, clasificar esos embriones en la categoría D.

La multinucleación es un criterio morfológico observado habitualmente, sobre todo en los días D+2 y D+3, y especialmente en el estadio de dos células. Dentro de la multinucleación se pueden distinguir dos tipos de alteraciones: la binucleación, cuando se visualizan dos núcleos en una misma blastómera, y la multinucleación propiamente dicha o micronucleación, cuando se observan más de dos núcleos en una misma blastómera.

Además de estos criterios, existen otras herramientas que se están utilizando con el fin de realizar una selección embrionaria más fina, como son el análisis del metabolismo de los embriones o el registro permanente en video del desarrollo embrionario (Time-Lapse), en el que se realiza una toma de imágenes de los embriones en intervalos de pocos minutos, que nos permite visualizar una grabación y así ver el desarrollo completo del embrión.

MULTINUCLEACIÓN Y TASAS DE IMPLANTACIÓN

A pesar de que la multinucleación es un fenómeno común, los rangos de incidencia varían mucho en los estudios presentados hasta la fecha. Esto podría deberse a que existe cierta dificultad en la visualización, sobre todo en D+3, debido al mayor número de células y a su disposición. Además, las variaciones entre observadores en la visualización de multinucleación se han reportado como significativas. Los estudios muestran frecuencias de entre 15 a 33% de embriones multinucleados en relación con el número de embriones totales y una incidencia del 14 al 79% de aparición de multinucleación por ciclo.

En embriones en estadio de dos células se encuentra multinucleación hasta en el 50% de los casos, siendo su presencia significativamente mayor que en el estadio de cuatro células.

Cuando estos embriones fueron transferidos se implantaron un 21% (4/19 casos) y de éstos llegaron a término 2 casos. Ambos presentaban una célula mononucleada y una binucleada.

Estos datos sugieren dos opciones, que la totipotencia celular puede originar un individuo a partir de una única blastómera o que las blastómeras binucleadas con un fallo de citocinesis podrían repararse y continuar el desarrollo. Otros estudios reportan implantación de embriones que en día 2 de desarrollo presentaban multinucleación en todas sus células.

Tomando en cuenta la micronucleación y la binucleación por separado, se encuentra mayor tasa de embarazo cuando se transfieren embriones mononucleados de cohortes con algún embrión con células binucleadas (48%) que cuando se transfiere embriones mononucleados de cohortes con algún embrión con micronucleación (15%).

Estudios en relación con los abortos también muestran mayor incidencia en el caso de embriones con blastómeras multinucleadas, 19% frente a un 3% en embriones que no presentan multinucleación (Jackson et al., 1998).

ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS

Los estudios de Hibridación in situ fluorescente (FISH, fluorescent in situ hybridization) muestran que el contenido de los núcleos de las blastómeras multinucleadas presenta anomalías cromosómicas, además, estas anomalías se observan en el conjunto de blastómeras de estos embriones, incluso en las células que no presentan multinucleación.

Diversos estudios han analizado embriones multinucleados en estadio de dos células y han encontrado gran incidencia de anomalías cromosómicas, desde un 55 hasta un 100%. La diferencia entre estos estudios depende del número de cromosomas analizados. En un análisis de 498 embriones se encontró que un 71,9% de los embriones multinucleados presentaban anomalías cromosómicas.

También se han analizado por separado los embriones con blastómeras multinucleadas y los que poseen blastómeras binucleadas, y se ha encontrado diferencia en el porcentaje de anomalías, encontrando menos anomalías en las blastómeras binucleadas (68%) que en las blastómeras multinucleadas (96%), analizando los cromosomas 13, 18, 21, X e Y. Otros autores no han encontrado diferencias entre embriones binucleados y multinucleados, aunque en este último caso sólo se analizaban los cromosomas 18, X e Y.

Cuando se analizan anomalías cromosómicas excluyendo aneuploidías, las diferencias entre la tasa de anomalías aumenta, 74,5% de anomalías en embriones multinucleados frente a un 23,3% de anomalías en embriones no multinucleados (Kligman et al., 1996).

RELACIÓN CON OTROS PARÁMETROS MORFOLÓGICOS

Los embriones multinucleados presentan un número menor de células, mayor porcentaje de fragmentación, división irregular de las blastómeras, tamaño significativamente distinto entre las blastómeras y menor tasa de formación de blastocistos. Además, los embriones micronucleados presentan peor morfología y tienen menor tasa de formación de blastocistos que los embriones binucleados.

MECANISMO DE MULTINUCLEACIÓN

En humanos, al comienzo de la mitosis la envoltura nuclear se disgrega, permitiendo que los microtúbulos que surgen de los centrosomas citoplásmicos entren en contacto con los cromosomas y se produzca la correcta segregación de éstos. Una vez terminada la mitosis, la envoltura nuclear se ensambla alrededor de dos masas de DNA para formar los núcleos de las células hijas. Resulta fundamental que la membrana nuclear rodee por completo estas dos masas de cromosomas para la correcta formación de los núcleos; después será necesario que la membrana nuclear crezca hasta alcanzar finalmente su tamaño normal durante la interfase.

Durante la mitosis de mamíferos, una larga porción de retículo endoplásmico liso (REL) se convierte en túbulos. En la telofase, estos túbulos contactan con la cromatina comenzando con el ensamblaje de la membrana nuclear a su alrededor. Este proceso es debido a que la membrana nuclear asociada al REL tiene proteínas que poseen gran afinidad por la cromatina. Posteriormente estos túbulos se van a estrechar y a unir para alcanzar la configuración de doble membrana ; por último se ensamblan los poros nucleares.

El éxito del ensamblaje de la membrana nuclear es la construcción de un núcleo único del tamaño y la forma apropiados. La micronucleación se produce por la rotura de un cromosoma o por una mitosis imperfecta en la que una porción o un cromosoma entero se separa de la masa de DNA. Cuando se ensambla la membrana, la porción de DNA que se ha separado forma su propia membrana debido a que va a ser rodeada por los túbulos de REL. Por lo tanto, la distancia física entre los cromosomas durante la telofase resulta crucial para el correcto encapsulamiento de la cromatina en un núcleo único.

El mayor grado de compactación de los cromosomas se produciría durante la anafase tardía. Diversos estudios que bloquean factores necesarios para esta compactación consiguen la aparición de núcleos anormales, pero no de multinucleación.

Hasta ahora, sólo en ratones Knock out para la proteína Kid se ha observado la aparición de multinucleación. Esta proteína afecta a la compactación en todos los ciclos celulares, pero es necesaria para prevenir la formación de micronúcleos sólo en el oocito en meiosis y en las primeras divisiones mitóticas. Esto sugiere que la extrema compactación de los cromosomas sólo sería necesaria para prevenir la multinucleación durante los primeros ciclos celulares. Es decir, la regulación máxima se produce en las etapas críticas, ya que cualquier alteración afecta al conjunto de células en mayor proporción. Estas evidencias muestran que existen muchos factores que regulan la formación de un núcleo único.

Además, otro mecanismo por el cual se produciría la multinucleación sería un mal funcionamiento del huso mitótico, que provocaría divisiones anormales y el desplazamiento incorrecto de los cromosomas hacia las futuras células hijas. El huso meiótico del oocito también es muy frágil, sensible a la temperatura, ya que descensos bruscos de la temperatura provocarían la despolarización de los microtúbulos, causando anomalías cromosómicas.

La cariocinesis sin citocinesis resulta en una célula binucleada. Cuando se analizan embriones con blastómeras binucleadas con núcleos de tamaño similar, se puede evidenciar que estas blastómeras provienen de un fallo en la citocinesis, generalmente entre la segunda y la cuarta división (Hardy et al., 1993). Posteriormente, estas células pueden terminar de dividirse y formar dos blastómeras aparentemente normales, aunque estas células han permanecido 48 horas sin dividirse (Moriwaki et al., 2004) y por tanto podrían tener algún tipo de anomalía que afecte al desarrollo.

ORIGEN DE LA MULTINUCLEACIÓN

La multinucleación no aparece por una sola causa, incluso algunos estudios sugieren que la multinucleación y la binucleación podrían tener un origen distinto. En el caso de la binucleación, ésta sería causada en su mayor parte por anomalías en el gameto femenino u oocito (Meriano et al., 2004).

Factor femenino:

En un estudio en el que se analizan las condiciones del líquido intrafolicular, se observa que más del 90% de embriones que tenían al menos una blastómera multinucleada en el estadio de dos células, se habían originado a partir de oocitos aparentemente normales, pero que habían madurado en folículos en condiciones de hipoxia severa (Van Blerkom et al., 1997).

De la misma forma, se observa una mayor incidencia de multinucleación cuando los oocitos fecundados son oocitos madurados in vitro (Nogueira et al., 2000). Por lo tanto, los procesos que ocurren durante la maduración del oocito in vivo son necesarios para un correcto desarrollo embrionario (Meriano et al., 2004).

Estos datos, junto con la observación de una mayor tasa de multinucleación en ciclos con mayor número de oocitos recuperados (Jackson et al., 1998; Van Royen et al., 2003), apuntan al hecho de que la administración de gonadotropinas exógenas debido al tratamiento podría aumentar la aparición de multinucleación. A pesar de que algunos estudios confirman esta relación (Jackson et al., 1998), otros no la encuentran (Van Royen et al., 2003).

Los pacientes con baja concentración de FSH en el día 3 de estimulación tienden a tener una mayor incidencia de multinucleación. De acuerdo con los datos de otros estudios, la observación de una mayor tasa de multinucleación en pacientes que requieren una dosis mayor, así como en pacientes con ciclos más cortos, sugieren que en los dos casos la causa puede ser un mayor número de folículos inmaduros en el momento de la inducción de la ovulación. Los folículos inmaduros podrían alcanzar la metafase II, pero ni el núcleo ni el citoplasma habrían alcanzado la madurez necesaria y no serían capaces de dividirse apropiadamente (Van Royen et al., 2003).

A pesar de que la aparición de aneuploidías sí está relacionada con la edad materna, no está claro si ocurre así con la multinucleación, ya que hay estudios con resultados contradictorios al respecto (Balakier and Cadesky, 1997; Elder and Cohen, 2005).

Factor masculino:

Se ha observado una diferencia en la incidencia de multinucleación entre los tratamientos de ICSI y FIV, 18,3% frente a 17,2% (P<0,001). Además se observa multinucleación en el 22% de los casos en los que existe un factor masculino de infertilidad severo (Walmsley, 2003), aunque en otros estudios esta tendencia no ha sido confirmada (Van Royen et al., 2003).

El centrosoma procedente del espermatozoide es necesario para la formación del huso, y anomalías en estas estructuras provocan fallos en la división y el arresto mitótico (Palermo et al. 1997), aunque estos mecanismos no han sido relacionados con la multinucleación.

Condiciones de cultivo:

En estudios multicéntricos se han encontrado diferencias estadísticamente significativas en la aparición de anomalías cromosómicas, lo que podría denotar una influencia de los medios de cultivo o de los tratamientos utilizados (Munne et al., 1997). En un estudio se muestra que los pacientes en los que el cultivo se llevó a cabo en Fluido Tubárico Humano (HTF) suplementado con suero materno presentaron una tasa mayor de multinucleación que aquellos en los que el cultivo se realizó con HTF suplementado con albúmina sérica humana (HSA) (Elder and Cohen, 2005).

MATERIAL Y MÉTODOS

PROCEDIMIENTO

La técnica utilizada en todos los ciclos es la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).

SELECCIÓN EMBRIONARIA según criterios ASEBIR 2008

La evaluación de la fecundación se realiza mediante la visualización de dos pronúcleos sin la presencia de anomalías.

Fig.3: Cigoto fecundado con dos pronúcleos visibles.

En los días posteriores se realiza la valoración de los embriones siguiendo cuatro criterios principales:

1.- Según número de células: en una división normal, en el día 2 de desarrollo el embrión debería tener 4 células (Figura 4), en el día 3 debería tener 8 células (Figura 5) y en el día 5 debería ser ya un blastocisto (Figura 6).

– Día 2:

Figura 4. Embrión de cuatro células en D+2.

– Día 3:

Figura 5. Embrión de 8 células en D+3.

– Día 5.

Figura 6. Blastocisto en D+5.

2.- Según el grado de fragmentación: · fragmentación inferior al 10%

• Fragmentación entre el 11-25%
• Fragmentación entre el 26-35%
• Fragmentación superior al 35% (Fig. 7).

3.- Según la igualdad en el tamaño de las blastómeras: en el día 2 –estadio 4 células- si la diferencia entre el diámetro de la blastómera de mayor tamaño y la de menor tamaño es superior al 20 % del diámetro de la menor, se considera un embrión con células desiguales.

Figura 7. Embrión con más de un 35% de fragmentación y células desiguales.

4.- Según ausencia de blastómeras multinucleadas: cada blastómera debe presentar un núcleo único (Figura 12). Si en alguna de ellas aparece más de un núcleo, se considera una blastómera multinucleada. Si un embrión presenta más de una blastómera multinucleada se considera que su potencial implantatorio está seriamente comprometido.

Figura 12. Embrión de 4 células en D+2 con las cuatro blastómeras mononucleadas.

Por tanto, un embrión óptimo es aquel que:

• En el día 2 tiene 4 células, todas ellas de tamaño similar, con menos del 10 % de fragmentación y ausencia de blastómeras multinucleadas.
• En el día 3 tiene 8 células de tamaño similar, con menos del 10 % de fragmentación y ausencia de blastómeras multinucleadas.
• En el día 5 ha formado la cavidad del blastocisto (Blastocele), tiene un trofoectodermo bien desarrollado y una masa celular interna bien formada.

TRANSFERENCIA Y RESULTADOS

Una vez realizada la valoración morfológica, se seleccionan los embriones a transferir. La transferencia es realizada mediante un catéter en condiciones de esterilidad. Cuando los embriones han sido transferidos al útero de la paciente, el catéter es revisado en el laboratorio para comprobar que la transferencia ha sido correcta.

La prueba de embarazo se realiza 14 días después de la transferencia, mediante la medición de β-hCG en sangre, y en caso de ser positiva, se confirma el embarazo dos semanas después mediante ecografía y detección del latido cardiaco.

DISEÑO DEL ESTUDIO

Se analizan retrospectivamente todos los ciclos con embriones mononucleados y multinucleados de implantación conocida que fueron transferidos en el día 2 de desarrollo durante los años 2009 y 2010.

Se incluyen pacientes hasta 38 años cuyos ciclos han sido realizados con sus propios oocitos y receptoras de óvulos, ya que estos oocitos siempre se obtienen de una mujer menor de 35 años.

Todas las pacientes fueron tratadas con protocolos de estimulación estandarizados. Se excluyen los embriones con un 30% de fragmentación o más y los que presentan blastómeras de tamaño desigual, ya que estos factores influyen de por sí en el potencial implantatorio de los embriones.

Se realiza un análisis comparativo de las tasas de implantación de los embriones mononucleados frente a los multinucleados. Se mide la tasa de implantación como número de embriones con implantación conocida frente al total de embriones transferidos.

Para este análisis se define a los embriones multinucleados como cualquier embrión que presente más de un núcleo en alguna de sus blastómeras, distinguiendo como embriones binucleados aquellos que presentan sólo dos núcleos.

La implantación conocida se obtiene dependiendo del tipo de transferencias:

• En transferencias de un único embrión: implantación o no implantación.
• En transferencias de dos embriones de distinta calidad: implantación de los dos o no implantación.
• En transferencias de dos embriones de la misma calidad: implantación de dos embriones, de un embrión o no implantación.

Para llevar a cabo el estudio se crea una base de datos en la que se incluyen todas las características de los embriones que son recogidas en la práctica diaria en un total de 56 variables.

Se realiza el análisis estadístico en el programa SPSS STATISTICS 17.0. Las diferencias estadísticas fueron determinadas mediante el test de χ2.

RESULTADOS

Se recogen en la base de datos las características de un total de 1168 oocitos recuperados.

De éstos, se analizan 245 embriones transferidos en ciclos de FIV-ICSI en D+2: 74 embriones presentaban al menos una célula binucleada y 92 embriones presentaban un núcleo único en cada una de sus células.

En el grupo de embriones con células binucleadas, 3 de 57 embriones de implantación conocida dieron lugar a la formación de un saco gestacional (tasa de implantación = 5,3 %). En el grupo de embriones con células mononucleadas, 26 de 85 embriones de implantación conocida, dieron lugar a la formación de un saco gestacional (tasa de implantación = 30,6%). La diferencia entre grupos es estadísticamente significativa. (p<0,001 ) (Tabla 1).

Debido al bajo número de transferencias de embriones con blastómeras micronucleadas de implantación conocida (n=2), la tasa de implantación de embriones multinucleados corresponde sólo con la tasa de implantación de embriones con blastómeras binucleadas.

Tabla 1. Tasa de implantación de embriones multinucleados frente a la tasa de implantación de embriones mononucleados.

CONCLUSIONES

El análisis comparativo de la tasa de implantación de embriones multinucleados frente a la de embriones mononucleados, a diferencia de una comparación frente a la tasa general de implantación, nos muestra la diferencia real que existe entre embriones que presentan multinucleación y embriones que no la presentan.

Los resultados confirman que los embriones que poseen blastómeras binucleadas tienen una tasa de implantación significativamente menor que los embriones con blastómeras mononucleadas, y por tanto que la multinucleación reduce el potencial implantatorio de un embrión en gran medida.

Asimismo, la presencia de blastómeras con núcleos únicos es indicativa de una mejor calidad embrionaria y de una mayor tasa de implantación.

La visualización de multinucleación es habitual en la práctica diaria, pero es una de las características morfológicas que presentan mayor dificultad en su determinación debido a la necesidad de enfocar correctamente e incluso de girar los embriones para poder visualizar cada una de sus células, procedimiento que resulta tanto más complicado cuanto mayor número de células posee el embrión.

Además, hay que tener en cuenta que a pesar de que el embrión se encuentra en un medio tamponado y sobre una placa calefactada, el tiempo que se mantiene fuera del incubador debe ser el mínimo necesario. La tecnología actual nos permite visualizar los embriones mediante una cámara incorporada al microscopio que facilita que dos embriólogos puedan observar los embriones a la vez, aumentando la probabilidad de localizar cualquier anomalía y disminuyendo el tiempo que un embrión pasa fuera del incubador. Esto, unido a un correcto entrenamiento de los embriólogos que se encargan de valorar los embriones, disminuiría la diferencia significativa entre observadores que existen actualmente (Paternot et al., 2009).

Analizar la tasa de implantación de los embriones multinucleados requiere un gran número de ciclos de reproducción asistida, ya que los embriones que muestran multinucleación sólo son seleccionados para transferir en los casos en los que no hay embriones de mejor calidad. Por esta razón no existen estudios previos con los que comparar la tasa de implantación de embriones binucleados obtenida, pero esta sí entraría dentro de la designación de calidad D (11,7%), siguiendo el criterio de ASEBIR 2008.

La multinucleación parece no tener un origen único y hasta el momento existen todavía datos contradictorios respecto a diferentes factores que pudieran generarla. Es necesario aportar nuevos estudios que pudieran confirmar la relación entre la multinucleación y, por ejemplo, las dosis de gonadotropinas exógenas que se administra durante los tratamientos, o con cualquier otro factor que pudiera ser controlado dentro del laboratorio con el objetivo de disminuir la presencia de multinucleación y por tanto mejorar la calidad de los embriones (De Cássia et al., 2010; Jackson et al., 1998; Meriano et al., 2004).

En un momento como el actual en el que se buscan y analizan las características morfológicas necesarias para la unificación de criterios de selección embrionaria a nivel mundial (Racowsky et al., 2010; Alpha scientists in reproductive medicine and ESHRE special interest group of embryology, 2011), este estudio apoya la necesidad de considerar la multinucleación como una característica fundamental para valorar el potencial implantatorio de un embrión (Cuadros et al., 2011). Por lo tanto, la visualización de la multinucleación ha de ser considerada de gran importancia en la práctica habitual de un laboratorio de reproducción asistida.

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